Una de las palabras del año 2021 es PCR. La hemos escuchado miles de veces. En este artículo voy a hablar de qué es exactamente esta técnica y para qué se utiliza. En primer lugar decir que PCR viene de Reacción en Cadena de la Polimerasa. En inglés sería Polymerase Chain Reaction.
Por convenio los científicos utilizan las siglas de las palabras en inglés. De este modo se tiene un estándar con el que hablar con otros científicos. Del mismo modo que si eres ornitólogo para dirigirte a otro ornitólogo tienes que utilizar el nombre científico de un ave, puesto que independientemente del país, el nombre científico derivado del latín es único. Por tanto, es una buena idea el usar PCR y no las siglas en español RCP. O decir DNA (DeoxyriboNucleic Acid) en vez de ADN (Ácido DesoxirriboNucleico).
Qué significa PCR
PCR significa reacción en cadena de la polimerasa. Por tanto, se trata de una reacción química puesto que se utiliza una enzima (catalizador biológico que lleva a cabo la reacción) y un sustrato (el ácido nucleico diana a estudiar). En cadena porque se realiza varias veces encadenadas (varios ciclos). Y de la polimerasa puesto que es la enzima encargada de llevarla a cabo. Como su nombre indica, la enzima polimerasa, polimeriza, va uniendo nucleócidos a una cadena que se está formando.
Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de DNA particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una sola copia de ese fragmento original, o molde.
Introducción
La PCR se basa en repetir in vitro (en laboratorio) lo que la célula haría in vivo (dentro de lo vivo). Es una receta de cocina pero en vez de patatas y grelos, los componentes son bases nitrogenadas, fósforo, calor, cloruro de magnesio, cebadores, etc. Ocurren varios ciclos en los cuales se cambia la temperatura para desnaturalizar el DNA. Desnaturalizar el DNA consiste en que las dos hebras de DNA se separen, convirtiendo la doble hélice en dos hélices independientes.
El DNA es una doble hélice de ácido nucleico en el cual a una base nitrogenada (que pueden ser 4, Adenina, Timina, Citosina y Guanina) se enfrenta otra que siempre va a ser la misma puesto que la unión solo lo permite de una única manera. De este modo a una Adenina se enfrenta una Timina, y a una Citosina se enfrenta una Guanina. Es como una escalera de caracol en la cual cada peldaño lo forman dos baldosas unidas.
Uno de los procesos más importantes de una célula es la replicación. Mediante la replicación a partir de una célula obtenemos dos y las dos son copias idénticas la una de la otra. En la PCR existen sucesivos ciclos de desnaturalización, renaturalización y varios procesos replicativos, con lo cual al final vamos a obtener miles de moléculas del DNA del que partimos.
Historia y descripción del método
El método PCR fue descrito por Kary Mullis en 1985. Consiste en fijarse en la replicación del DNA en una célula y llevarlo a un proceso en el laboratorio. Partimos de DNA y aplicamos calor. Como consecuencia las dos hebras se separan. Las DNA polimerasas necesitan un primer, un cebador, se produce un RNA complementario. La célula necesita los polidesoxinucleótidos correspondientes, DNA polimerasas y un poco de Cl2Mg. Mullis se le ocurre que cogiendo una hebra, desnaturalizándola mediante calor, el DNA se separa. Si en este momento tengo unos primer que tuvieran la secuencia complementaria de alguno de los fragmentos de DNA y añado la DNA polimerasa, los desoxitrifosfatados y Cl2Mg, se copia el DNA. Si meto otro primer a una dilución de 1 ocurre lo mismo en esa cadena y se elonga el DNA.
Mullis tenía tres cubetas a diferente temperatura y unos eppendorf donde introduce el DNA patrón, donde le añade los primer o cebadores (unos 20 nucleótidos cada uno). Los desoxi dNTP de T, C, C y A, Cl2Mg. Se introducen los tubos a 92 ºC, se desnaturaliza el DNA patrón, durante 30-1 minutos y lo paso a otro baño a unos 50 ºC durante 1 minuto y lo que ocurre es que el DNA se renaturaliza. Para forzar que el DNA se renaturalize pongo con los primer una elevada concentración de cebadores. Ahora se introduce la DNA polimerasa Y. Se pasa a otro baño de unos 70 ºC durante 30-1 minuto.
Se vuelve a la primera cubeta, se pierde la DNA polimerasa pero el DNA se desnaturaliza despues del minuto se pasa a la tercera cubeta. Lo que se consigue es amplificar la cantidad de DNA, de muy pocas moléculas a muchas. Es un paso previo para otras cosas.
Problemas detectados en los comienzos en la PCR
Desde un punto de vista técnico habia varios problemas:
- Por un lado, había que introducir DNA polimerasa en cada ciclo puesto que al aplicar calor la enzima, que es una proteína, se desnaturalizaba (perdía sus propiedades). Por tanto, conllevaba un gasto importante de DNA polimerasa. Y además se debía evitar la contaminación de DNA foráneo puesto que en cada ciclo se aumentaba esa posibilidad .
- Otro problema es que la persona encargada de llevar a cabo la reacción tenía que estar concentrada durante las 3 horas del proceso.
- Al hacer una secuenciación de DNA con PCR se necesita saber la secuencia de antemano. No siempre se quiere la PCR para hacer una secuencia.
La Tag polimerasa
El primer problema se solventó al encontrarse una DNA polimerasa que soportaba altas temperaturas sin perder sus propiedades. Se sabía que existían bacterias en lugares con alta temperatura que realizaban todos los procesos normales de una célula. La bacteria Thermophylus acuaticus, vive en ambientes extremadamente calientes debido a que tiene enzimas que los soportan. Era de esas enzimas era la enzima TAG polimerasa que aguanta hasta los 92 ºC sen degradarse.
Para resolver el segundo problemas lo que se hizo fue tratar de mecanizar este proceso. Se inventó el termociclador. Es un instrumento donde se introducen los tubos eppendorf de un tamaño determinado. Tiene un sistema de calentamiento y enfriamiento rápido. Se programa el termocicloador para que realicén una una serie de ciclos.
Muchos termocicladores no bajan la temperatura más allá de la ambiental. Hay otros con un mecanismo de refrigeración para llegar a 4 ºC.
Con todo esto se consiguió la la automatización de la PCR. Sin embargo, la TAG polimerasa comete errores y tenía problemas en longitudes determinadas de DNA. Por tanto se buscaron enzimas que cometieran menos errores y soportaran DNAs más largo. Además la TAG no podía secuenciar más de 15.000 pb. Por tanto, se descartó su uso.
El coronavirus Sars-Cov-2
Pero… ¿qué es un virus? ¿Cual es su material genético? Un virus es un paquete microscópico de material genético rodeado por una envuelta. Este material genético puede ser o bien DNA o bien RNA
- DNA es un molécula formada por una doble cadena que se encuentra en todos los organismos, tales como animales, plantas y virus, y el cual contiene el material genético, por el cual todos los organismos están hechos.
- El RNA es generalmente una molécula de una sola hebra que copia, transcribe y transmite partes del código genético a las proteínas para que puedan sintetizar y realizar funciones que mantienen vivos y en desarrollo a los organismos. Diferentes variaciones de ARN se encargan de copiar, transcribir y transmitir. Algunos virus tales como el coronavirus SARS-CoV-2, el cual causa la enfermedad de la COVID-19, solo contiene RNA, lo que significa que dependen de la infiltración de células sanas para multiplicarse y sobrevivir.
Para utilizar la técnica de PCR es necesario que estemos trabajando con DNA, no sirve el RNA, debido a que se tienen que desnaturalizar dobles cadenas. A partir de una de las cadenas podemos sintetizar la otra. Por tanto no podemos trabajar directamente en el RNA del virus sars-cov-2.
La elección del RNA resuelve un problema que tiene este microscópico paquete de material genético llamado virus, y es que convenientemente para él es capaz de usar la maquinaria celular a su disposición para crear más copias de si mismo.
Una vez dentro de la célula, el virus utiliza su propio código genético – RNA en el caso del virus de la COVID-19 para tomar control y reprogramar la célula para convertirlas en un factoria de creación de nuevas copias de virus.
Para que un virus como lA COVID-19 se detecte temprano en el cuerpo mediante RT-PCR en tiempo real, los científicos deben convertir el ARN en ADN. Este es un proceso llamado “transcripción inversa”. Lo hacen porque solo se puede copiar o amplificar el ADN, que es una parte clave del proceso de RT-PCR en tiempo real para detectar virus. Los científicos amplifican una parte específica del ADN viral transcrito cientos de miles de veces. La amplificación es importante para que, en lugar de tratar de detectar una cantidad minúscula del virus entre millones de hebras de información genética, los científicos tengan una cantidad suficientemente grande de secciones diana de ADN viral para confirmar con precisión que el virus está presente.
Como funciona una de RT-PCR usada contra la COVID-19
En primer lugar se toma una muestra de una zona en la que el paciente pueda tener trazas de virus como puede ser la garganta, la nariz o la saliva. Se purifica la muestra obtenida para eliminar todo el material que no es necesario para la prueba de PCR. El extracto que se obtiene es una amalgama de material genético de la persona y si está presente, de material genético del virus.
El siguiente paso lo realiza la proteína llamada transcripción inversa, una enzima que es capaz de a partir de RNA convertirlo en DNA. A continuación, se añaden pequeños fragmentos adicionales de DNA que complementan determinadas partes del DNA vírico transcrito. Esos fragmentos se adhieren a partes específicas del DNA vírico de estar el virus presente en la muestra. Estos fragmentos genéticos añadidos permiten crear y amplificar nuevas cadenas de DNA que permiten posteriormente detectar el virus.
El proceso se automatiza mediante un aparato que realiza la RT-PCR, en el cual ese material se somete a ciclos continuos de subir la temperatura (para desnaturalizar) y bajar la temperatura (para naturalizar) y cada ciclo da lugar a nuevas copias idéntidas de partes específicas del DNA vírico.
Medidor del DNA vírico
A continuación, se introduce esa combinación en un aparato de RT-PCR, donde se someten a ciclos de calor-frío para provocar determinadas reacciones químicas que dan lugar a nuevas copias idénticas de partes específicas del DNA vírico. Esos ciclos se repiten una y otra vez para seguir copiando las partes específicas del DNA vírico.
En cada uno de ellos se duplican las cantidades: es decir, de dos copias, se pasan a cuatro; de cuatro, a ocho, y así sucesivamente. Un sistema habitual de RT-PCR en tiempo real suele constar de 35 ciclos, es decir, que al final del proceso se habrán creado unos 35 000 millones de copias nuevas de las partes del DNA vírico de cada una de las cadenas del virus presentes en la muestra.
A medida que se producen nuevas copias de las partes del DNA vírico creado invitro, los marcadores se acoplan a las cadenas de DNA y emiten una fluorescencia. El aparato que realiza la RT-PCR mide y presentará en la pantalla del ordenador el resultado en tiempo real.
La computadora hace un seguimiento de la escala de la fluorescencia de la muestra que se mide tras cada ciclo. Cuando esta supera un determinado nivel, un umbral de detección, se confirma la presencia del virus y el paciente es declarado positivo en virus sars-cov-2. A menos número de ciclos para obtener la fluorescencia mayor será la carga viral.
Referencias
- https://www.iaea.org/sites/default/files/6120811.pdf
- https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-381X2020000300316
- Apuntes carrera de Biología.
- https://www.youtube.com/watch?v=CxSu61UcQXk
- https://www.paho.org/es/node/60627
